PlasmidDNA추출실험

지난해 실험도 되돌아보고 정보가 필요한 전공생들을 위해 정리해둔다.같은 건국대 KIT생이 보면 재밌겠다 ㅋㅋㅋ Vector 란?

Vector는 DNA 캐리어를 말합니다.DNA 운반체의 종류로는 plasmid, viral vector, artificial chromosomes가 있다.DNA 운반체는 유전자 재조합 기술에 필수적으로 필요한 DNA 전달체다. 유전자 재조합 기술은 유전자를 편리하게 활용할 수 있도록 유전자를 확보, 증식, 단백질을 발현시킨다.그 결과 아래 사진에서 볼 수 있듯이 관심 있는 표적 DNA 조각을 DNA 캐리어의 특정 부위에 넣어 보관과 이용을 편리하게 하는 DNA 클로닝과 DNA의 대량 복제와 증식을 할 수 있다.클로닝된 DNA가 특정 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열로, DNA 캐리어에 유전자 발현에 필요한 프로모터를 포함하고 전사와 번역에 필요한 인자를 제공하면 단백질을 발현시킬 수 있다.

알칼리 용해법

Plasmid DNA를 추출하는 방법에는 여러 가지가 있지만 가장 보편적이며, 이번 실험에서도 다룬 방법이 ‘Alkaline lysis method’입니다.이 방법은 plasmid DNA 소량 추출법(miniprep)이라고도 하며, 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만 분리하는 것입니다.이때 세균이 가지고 있는 염색체 DNA와 plasmid DNA를 구분해서 분리해야 합니다. 둘 다 DNA라 구별이 쉽지 않지만 염색체 DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되어 plasmid DNA보다 상당히 크기 때문에 이러한 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있습니다.

Solution 역할

-Sol 1EDTA, RNase, glucose, Tris-CL이 있다.cell wall을 파괴하고 RNA분해를 촉진한다.Glucose는 삼투압 유지, Tris-Cl은 pH유지, EDTA은 킬레이트로 세포 벽에 있는 이온을 제거하고 세포 벽을 파괴한다.특히 Ca2+의 경우 세균 세포 벽의 안정성을 유지하는데 중요하기 때문에 EDTA을 사용하면 세포 벽의 분석이 쉽게 된다.RNase는 RNA을 파괴하고 이번 실험의 목표물인 plasmid DNA채취를 돕는다.-Sol 2SDS, NaOH가 있다.주로 Alkaline lysis와 세포막 분해, DNA와 RNA변성 단백질 제거 역할을 한다.NaOH는 높은 pH를 유도하고 plasmidDNA와 유전체 DNA의 양쪽을 변성시킨다.SDS는 계면 활성제이다.그러므로 친수성, 소수성 부분을 모두 가진 인지질로 구성된 세포막을 분해하는 것을 돕는다.-Sol 3종류에는 초산 칼륨이 있어 lysis buffer때문에 높아진 pH를 다시 중성으로 내린다.그 결과, 변형된 plasmid DNA가 복구한다.실험 재료

피펫,팁,원심분리기,튜브,버퍼S1,S2,S3,세척액,EB실험 과정

1)아기의 플레이트로 자란 colony를 밤새도록 키운다.2)약 500마이크로 리터 정도 배양지에서 꺼냈습니다. 튜브에 옮긴다.3)Centrifuge에 돌리다.4)pipette에서 상층 액을 모두 빼내고 pellet만 남긴다.5)라이 시스 솔루션(S1)을 250마이크로 리터집, pipetting을 하면서 섞는다.6) 같은 양의 S2를 넣고 튜브를 앞뒤로 천천히 잦히다.7)S3 350마이크로 리터를 넣고 앞뒤로 천천히 잦히다.8)Centrifuge에 넣어 5분 돌리다.9)칼럼이 들어 있는 튜브에 용액을 쉽게 따르다.10)여과된 용액을 다시 Centrifuge에 넣어 5분 돌리다. 11)추출된 DNA에 washing solution을 700마이크로리터 넣어 wash한다.12)Centrifuge에 돌리고 여분의 solution을 제거한다.13)칼럼 안의 필터에 부착된 DNA을 추출하기 위해서 EB200마이크로 리터를 넣는다.14)Centrifuge에 10분 돌린 후 DNA을 회수하다.회수한 DNA는 다른 제한 효소로 자른 뒤 다른 실험 과정을 거쳐서 농도를 확인할 수 있다.결과 및 고찰

DNA의 A260/A280(A260:DNA측정치, A280:단백질 측정치)이 1.8~2.0사이의 값을 갖고 있는지를 비교하면 DNA순도를 파악할 수 있다.저의 실험 결과인 1-3조를 보았을 때 A260/A280이 1.85의 값을 가지므로 순수한 DNA임을 확인했다.또 Concentration치는 높을수록 불순물과 기타 물질을 포함하지 않고 DNA만을 가려낸 것이다.모든 반 값을 보면 195~407사이의 값이 나왔는데, 1-3조는 313.76이 나오니 꽤 잘 추출했다고 생각한다.시험 도중 pipette에서 상층 액을 모두 채취하고 pellet만을 남기는 과정에서 pellet가 흡입되는 것이 아닌가 하고 상층 액을 깨끗하게 채취하지 못 했다.Pipetting이 잘 되지 않아 발생한 문제이므로 다음의 실험에서는 서서히 보완하고 결과 오차를 줄이자.또 그 다음 과정인 pellet에 S1250마이크로리터를 넣어 pipetting을 하면서 혼합 과정에서 pellet이 냉동된 pellet을 써서 pipetting만으로 완전히 녹지 않았다.결국 Vortex를 이용하고 추가적으로 녹일에서 해결했지만 완전히 녹지 않거나 DNA손상이 발생될 수 있어, 실험 결과에 오차가 발생할 수 있는 실수이다.하지만 이는 실험 재료 준비의 문제여서 냉동 pellet을 쓰지 않으면 오차 범위를 줄일 수 있다.참고자료 https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1110579&cid=40942&categoryId=32317https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5703186&cid=61232&categoryId=61232https://www.google.com/search?q=%ED%94%8C%EB%9D%BC%EC%8A%A4%EB%AF%B8%EB%93%9C+dna+%EC%B6%94%EC%B6%9C&sxsrf=ALeKk00pFjN8HEL2yPW5gyBLAlqz2SABOw:1607100679925&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwjKopTJ5LTtAhXEBKYKHfNTBXQQ_AUoAXoECAkQAw&biw=1536&bih=754#imgrc=Mf4ubtH0DAXDYM